油橄榄(Olea europaea L.)属木犀科木犀榄属，其具有较强的抵抗微生物侵袭能力[1]，可生长几百年。油橄榄叶提取物早已被地中海地区的人们当作民间医药来治疗发烧和其他疾病如疟疾等[2]。油橄榄叶提取物具有强的抑菌活性并可分离出橄榄苦苷且含量很高[3]。橄榄苦苷是一种无毒、易被人体吸收[4]的苯酚类裂环环烯醚帖苷化合物，有清除超氧阴离子自由基(O2-·)、过氧化氢(H2O2)、NO•和过氧亚硝基阴离子(ONOO-)的能力[5]，还有抗癌[6-7]、抗血栓[8]、预防动脉硬化和神经保护[9-10]等作用。

　　本实验通过评价橄榄苦苷的体外抗氧化活性和抑菌活性，为油橄榄叶和橄榄苦苷的药理活性研究、拓宽应用途径提供实验依据和理论基础。

　　1、橄榄苦苷体外抗氧化活性分析

　　(1)总抗氧化能力

　　在酸性条件下，Fe3+-TPTZ可被还原性物质还原为Fe2+-TPTZ形式，呈现出明显的蓝色，于593 nm波长处具有最大吸收峰。在Fe3+-TPTZ过量的情况下，检测蓝色物质的生成量可以反映待测物质的总抗氧化能力。如图2所示，橄榄苦苷总抗氧化能力明显强于BHT(butylatedhydroxytoluene简称，中文名抗氧剂264)，在0.02～0.08 mg/mL质量浓度范围内橄榄苦苷和BHT总抗氧化能力与其质量浓度成正相关。当质量浓度为0.08 mg/mL时橄榄苦苷抗氧化能力为(52.90±1.58)%，BHT为(48.46±0.03)%。橄榄苦苷总抗氧化能力的IC50为(0.075±0.002)mg/mL，在研究质量浓度范围内BHT总抗氧化能力低于50%。

　　(2)总还原能力

　　由K3Fe(CN) 6反应成K4Fe(CN) 6，并进一步生成Fe 4[Fe(CN) 6] 3，这是一有色反应的过程，在700 nm波长处有最大吸收峰，吸光度越大则样品的还原力越强。如图3所示，当质量浓度为0.08 mg/mL时，橄榄苦苷总还原能力为(87.59±0.12)%，BHT为(74.66±3.61)%。橄榄苦苷IC50为(0.014±0.001)mg/mL，BHT的IC50为(0.023±0.003)mg/mL，IC50差值约0.010 mg/mL，表明橄榄苦苷的总还原能力强于BHT。橄榄苦苷比BHT有更强的总抗氧化能力和总还原能力，这可能是因为羟基邻位二取代的结构使其具有更强的稳定和抗氧化活性[11]。

　　2、橄榄苦苷抑菌活性分析

　　(1)抑菌活性

　　橄榄苦苷对3 种细菌的抑菌圈大小和细菌的敏感程度如表1所示。3 种细菌对甲醇表现出不敏感或敏感度不明显，橄榄苦苷对3 种细菌都有抑菌作用。在不同质量浓度下，橄榄苦甙对3种细菌的敏感度也不同。

　　结果显示橄榄苦苷对大肠杆菌的抑菌活性最强，其次为金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌对橄榄苦苷表现出敏感度不高。众所周知，苯酚类或抗氧化物通过与细胞的肽聚糖作用破坏细胞壁结构或损害细胞膜，两者一起作用抑制细菌的生长。由于橄榄苦苷羟基邻位二取代结构的稳定性强，以及大肠杆菌(革兰氏阴性菌)细胞壁肽聚糖含量低和层次少，橄榄苦苷易于进入和产生抑制作用。金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，菌体细胞壁结构紧密，以及芽孢强抗逆性使得橄榄苦苷对枯草芽孢杆菌的作用较弱。

　　3、橄榄苦苷对细菌生长曲线的影响

　　(1)橄榄苦苷对大肠杆菌生长曲线的影响

　　大肠杆菌在添加不同质量浓度橄榄苦苷培养基中培育36 h的生长状况如图4所示。

　　无菌水代替橄榄苦苷溶液的培养基中细菌在培养6 h后细菌数增长明显加快，6～12 h为大肠杆菌的快速生长期。在以甲醇(0.00 mg/mL)代替橄榄苦苷溶液的培养基中大肠杆菌在培养6 h后细菌数开始增长，1 2 h后适应环境并快速繁殖，在12～18 h处于快速生长期并达到最大菌液浓度，与无菌水组比较，此时细菌的快速生长期相对延缓，说明甲醇对大肠杆菌的生长有一定的影响。当添加质量浓度为0.01 mg/mL橄榄苦苷溶液时，培养到18 h后大肠杆菌开始增长，在培养24～30 h时处于对数生长时期。橄榄苦苷质量浓度为0.05、0.10 mg/mL时，在培养24 h后细菌生长并快速进入对数期，培养30 h后细菌数还在增加。在质量浓度为0.50、1.00 mg/mL时，36 h内大肠杆菌的生长完全被抑制，说明橄榄苦苷对大肠杆菌的最低抑菌浓度<0.50 mg/mL。表明大肠杆菌随着橄榄苦苷质量浓度的增加，快速生长期被相应延缓或推迟，细菌的生长周期被相应延长，但是对数期生长速率没有受到多大影响。

　　(2)橄榄苦苷对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响

　　如图5所示，在添加无菌水培养基中金黄色葡萄球菌培养6 h后数目增加，在培养12 h左右进入对数生长时期，培养18 h附近达最大吸光度，此后细菌数开始缓慢降低。甲醇组(0.00 mg/mL)中的细菌在培养12 h后细菌数增加较快，18 h左右进入对数期，培养24 h后达最大菌液浓度，此时对数期相对无菌水组被延缓，说明甲醇对金黄色葡萄球菌有一定抑菌作用。在加有质量浓度为0.01、0.05 mg/mL橄榄苦苷溶液的培养基中，金黄色葡萄球菌在培养18 h后繁殖较快，数目增加明显，24 h左右进入对数生长状态，培养30 h后金黄色葡萄球菌数趋于稳定。当质量浓度为0.10 mg/mL时，培养18 h细菌开始适应环境，24 h后进行快速生长，对数期出现在培养至24～30 h之间。质量浓度为0.50、1.00 mg/mL时36 h内橄榄苦苷完全抑制金黄色葡萄球菌的生长，此时生长曲线为水平状态，表明橄榄苦苷对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度<0.50 mg/mL。橄榄苦苷对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响同样表现在对细菌对数生长期的延缓。

　　(3)橄榄苦苷对枯草芽孢杆菌生长曲线的影响

　　由图6可知，无菌水组和甲醇组的枯草芽孢杆菌生长曲线趋于一致，在培养6 h后细菌数开始增长，6～12 h处于快速生长期，此后细菌数保持相对稳定并开始降低，说明甲醇对枯草芽孢杆菌影响不大或没有抑制作用。当橄榄苦苷质量浓度为0.01、0.05、0.10 mg/mL时，枯草芽孢杆菌的快速生长被延缓到12～24 h，此时对数生长期被延缓，细菌生长速率减慢且所需时间范围变大。当质量浓度为0.50 mg/mL时，枯草芽孢杆菌在培养18 h后细菌数迅速增加，于18～24 h达对数生长状态。橄榄苦苷质量浓度为1.00 mg/mL时，36 h内枯草芽孢杆菌的生长被完全抑制，表明橄榄苦苷对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度<1.00 mg/mL。橄榄苦苷对枯草芽孢杆菌生长曲线的影响表现在细菌数开始增加到进入对数生长期和菌液浓度达最大所需的时间范围被延长，主要还是表现为对快速生长时期的抑制作用。

　　分别以无菌水和甲醇作为对照，比较不同质量浓度橄榄苦苷对3 种细菌生长曲线的影响，结果如表2所示，甲醇对枯草芽孢杆菌的影响很小或没有抑制作用，甲醇对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，但是在抑菌圈测试中，这种作用不明显，可能是甲醇量少、易挥发以及橄榄苦苷在琼脂培养基中扩散效果不好，且微溶于水所致。无论以无菌水还是甲醇作为对照，橄榄苦苷对大肠杆菌的生长抑制效果最佳，对数期被延缓18、12 h。橄榄苦苷对金黄色葡萄球菌的抑制效果其次，在0.01、0.05 mg/mL质量浓度时，金黄色葡萄球菌生长的对数期被延缓12 h，质量浓度达0.10 mg/mL时被延缓18 h，以甲醇为对照被延缓12 h。橄榄苦苷对枯草芽孢杆菌的生长抑制效果相对较弱，在0.01～0.10 mg/mL质量浓度内，橄榄苦苷对其对数生长期都延缓6 h，在质量浓度0.50 mg/mL时被延缓12 h。橄榄苦苷对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最低抑制浓度范围分别为<0.50 mg/mL、<0.50 mg/mL、<1.00 mg/mL。

　　采用稀释法分析橄榄苦苷对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度(图7)，在质量浓度<0.2 mg/mL时，橄榄苦苷对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制作用较强，对枯草芽孢杆菌抑制作用较弱。当橄榄苦苷质量浓度≥0.025 mg/mL时，大肠杆菌吸光度趋为零，因此橄榄苦苷对大肠杆菌的最低抑菌浓度(minimalinhibitory concentration，MIC)为0.025 mg/mL;当橄榄苦苷质量浓度≥0.05 mg/mL时，金黄色葡萄球菌没有生长，MIC为0.05 mg/mL。有研究报道[21]橄榄苦苷对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度为0.0312～0.125 mg/mL，与本实验结果相符合;枯草芽孢杆菌随橄榄苦苷质量浓度的增加细菌数减少、生长减慢，在质量浓度>0.1 mg/mL时，培养液的吸光度迅速降低，此时橄榄苦苷浓度细菌生长抑制作用较强，当质量浓度为0.4 mg/mL时，枯草芽孢杆菌生长被完全抑制，此为其最低抑菌浓度。

　　4、结 论

　　橄榄苦苷体外抗氧化和抑菌活性实验结果表明：橄榄苦苷具有强的体外抗氧化活性和抑菌作用。在0.02～0.08 mg/mL质量浓度范围内，与BHT相比较，橄榄苦苷表现出强的总抗氧化能力和总还原能力，总抗氧化能力测定结果表明，橄榄苦苷的IC50为(0.075±0.002)mg/mL，而此时BHT的抗氧化率低于50%;总还原能力测定结果表明，橄榄苦苷的IC50为(0.014±0.001)mg/mL，BHT的IC50为(0.023±0.003)mg/mL，差值为0.010 mg/mL。在所研究质量浓度范围内，橄榄苦苷对大肠杆菌抑制作用最强，抑菌圈直径可达(20.77±0.47)mm，MIC为0.025 mg/mL;金黄色葡萄球菌对橄榄苦苷表现出高度敏感(d=(19.23±0.44)mm)，MIC为0.05 mg/mL;而橄榄苦苷对枯草芽孢杆菌抑制作用相对较弱，处于中度敏感状态，MIC为0.4 mg/mL。橄榄苦苷对3 种细菌生长曲线的影响表现在对其对数生长期的延缓。对大肠杆菌的抑制作用极显著强于金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌(P<0.01)，金黄色葡萄球菌对橄榄苦苷的敏感度高于枯草芽孢杆菌(P<0.05)。这为橄榄苦苷在食品、化妆品和医药等领域的应用和研究提供了参考。

       文献参考

　　[1]KESKIN D, CEYHAN N, UĞUR A, et al. Antimicrobial activity andchemical constitutions of West Anatolian olive (Olea europaea L.) leaves[J].Journal of Food, Agriculture & Environment, 2012, 10(2): 99-102.

　　[2]SIFAOUI I, LÓPEZ-ARENCIBIA A, MARTÍN-NAVARRO C M,et al. Activity assessment of Tunisian olive leaf extracts against thetrophozoite stage of Acanthamoeba[J]. Parasitology Research, 2013,112(8): 2825-2829.

　　[3]KORUKLUOGLU M, SAHAN Y, YIGIT A, et al. Antibacterial activityand chemical constitutions of Olea europaea L. leaf extracts[J]. Journal ofFood Processing and Preservation, 2010, 34(3): 383-396.

　　[4]TAN Haiwei, TUCK K L, STUPANS I, et al. Simultaneousdetermination of oleuropein and hydroxytyrosol in rat plasma usingliquid chromatography with fluorescence detection[J]. Journal ofChromatography B, 2003, 785(1): 187-191.

　　[5]CZERWIŃSKA M, KISS A K, NARUSZEWICZ M. A comparison ofantioxidant activities of oleuropein and its dialdehydic derivative fromolive oil, oleacein[J]. Food Chemistry, 2012, 131(3): 940-947.

　　[6]BULOTTA S, CORRADINO R, CELANO M, et al. Antiproliferativeand antioxidant effects on breast cancer cells of oleuropein and itssemisynthetic peracetylated derivatives[J]. Food Chemistry, 2011,127(4): 1609-1614.

　　[7]BULOTTA S, CORRADINO R, CELANO M, et al. Antioxidantand anti-growth action of peracetylated oleuropein in thyroid cancercells[J]. Journal of Molecular Endocrinology, 2013, 51(1): 181-189.

　　[8]DUB A M, DUGANI A M. Antithrombotic effect of repeated dosesof the ethanolic extract of local olive (Olea europaea L.) leaves inrabbits[J]. The Libyan Journal of Medicine, 2013, 8(1): 1-6.

　　[9]URPI-SARDA M, CASAS R, CHIVA-BLANCH G, et al. Virginolive oil and nuts as key foods of the Mediterranean diet effects oninflflammatory biomarkers related to atherosclerosis[J]. PharmacologicalResearch, 2012, 65(6): 577-583.

　　[10] MOHAGHEGHI F, BIGDELI M R, RASOULIAN B, et al. Theneuroprotective effect of olive leaf extract is related to improvedblood-brain barrier permeability and brain edema in rat withexperimental focal cerebral ischemia[J]. Phytomedicine, 2011, 18(2):170-175.

　　[11] TRIPOLI E, GIAMMANCO M, TABACCHI G, et al. The phenoliccompounds of olive oil: structure, biological activity and benefificial effectson human health[J]. Nutrition Research Reviews, 2005, 18(1): 98-112.